آموزش استفاده از فاز متحرک در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
مقدمه
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک تکنیک قدرتمند برای جداسازی و تحلیل ترکیبات مختلف در نمونه‌های پیچیده است. یکی از مهم‌ترین عوامل در اجرای موفقیت‌آمیز کروماتوگرافی مایع، انتخاب و استفاده صحیح از فاز متحرک است. فاز متحرک نقشی حیاتی در انتقال نمونه از طریق ستون و جداسازی مواد آن دارد. در این مقاله به آموزش انتخاب، آماده‌سازی و استفاده از فاز متحرک در تکنیک HPLC می‌پردازیم.
فاز متحرک چیست؟
فاز متحرک در HPLC یک حلال یا ترکیبی از حلال‌ها است که وظیفه حمل نمونه از طریق ستون کروماتوگرافی را بر عهده دارد. در طول فرایند کروماتوگرافی، فاز متحرک برهمکنش‌هایی با مواد نمونه برقرار می‌کند که منجر به جداسازی آن‌ها بر اساس تفاوت در تمایل به فاز ثابت (ستون) می‌شود.
انتخاب فاز متحرک مناسب
انتخاب فاز متحرک مناسب برای HPLC یکی از اولین و مهم‌ترین مراحل در آنالیز است. ویژگی‌های فاز متحرک باید با نوع ستون، ترکیبات نمونه، و نوع آشکارساز همخوانی داشته باشد. معمولاً فاز متحرک باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:
- قطبیت مناسب: بر اساس قطبیت ترکیبات مورد آنالیز، باید فاز متحرکی انتخاب شود که توانایی حل‌کردن ترکیبات و ایجاد جداسازی بهینه را داشته باشد.
- برای جداسازی ترکیبات قطبی، از فاز متحرک قطبی (مانند آب یا متانول) استفاده می‌شود.
- برای ترکیبات غیرقطبی، از حلال‌های غیرقطبی مانند هگزان یا کلروفرم استفاده می‌شود.
- سازگاری با آشکارساز: آشکارسازهای مختلف نیازمند فازهای متحرک خاصی هستند. برای مثال، در آشکارساز UV-Vis، فاز متحرک نباید دارای جذب در طول موج مورد نظر باشد.
- ثبات و پایداری: فاز متحرک باید پایداری خوبی در طول آنالیز داشته باشد و با فاز ثابت (ستون) واکنش ندهد.
انواع فاز متحرک
فازهای متحرک در HPLC به دو دسته اصلی قطبی و غیرقطبی تقسیم می‌شوند. در ادامه به معرفی برخی از فازهای متحرک رایج می‌پردازیم:
- آب: یکی از پرکاربردترین فازهای متحرک در HPLC برای جداسازی ترکیبات قطبی است. معمولاً با مواد آلی مانند متانول یا استونیتریل ترکیب می‌شود تا قطبیت فاز متحرک را تنظیم کند.
- متانول: متانول به عنوان یک حلال قطبی برای ترکیبات نیمه‌قطبی و قطبی مناسب است. متانول معمولاً با آب به عنوان فاز متحرک برای جداسازی ترکیبات دارویی و غذایی استفاده می‌شود.
- استونیتریل: این حلال قطبی در بسیاری از جداسازی‌های HPLC به کار می‌رود و به دلیل پایداری شیمیایی و توانایی حل‌کردن طیف وسیعی از ترکیبات، یکی از انتخاب‌های رایج در HPLC است.
- هگزان: به عنوان یک حلال غیرقطبی برای جداسازی ترکیبات غیرقطبی مانند چربی‌ها و روغن‌ها استفاده می‌شود.
آماده‌سازی فاز متحرک
برای دستیابی به نتایج دقیق و تکرارپذیر، فاز متحرک باید به دقت آماده شود. مراحل آماده‌سازی به شرح زیر است:
- انتخاب ترکیب مناسب حلال‌ها: با توجه به ویژگی‌های نمونه و ستون، نسبت مناسب از حلال‌ها انتخاب می‌شود. برای مثال، فاز متحرک آب:متانول با نسبت ۷۰:۳۰ یکی از ترکیبات رایج برای جداسازی ترکیبات قطبی است.
- حذف ذرات معلق و هوا: حلال‌ها باید از هرگونه ذرات معلق و گازهای محلول خالی شوند. این کار با استفاده از فیلتراسیون و دگازاسیون (حذف هوا) انجام می‌شود. فیلترهای ۰.۴۵ یا ۰.۲۲ میکرومتر برای حذف ذرات معلق استفاده می‌شوند.
- تنظیم pH فاز متحرک: در برخی از جداسازی‌ها، تنظیم pH فاز متحرک بسیار مهم است، به ویژه برای آنالیز ترکیبات اسیدی یا بازی. تنظیم pH معمولاً با اضافه‌کردن اسید (مانند اسید فسفریک) یا باز (مانند سدیم هیدروکسید) انجام می‌شود.
استفاده از فاز متحرک در دستگاه HPLC
- پر کردن مخزن فاز متحرک: پس از آماده‌سازی، فاز متحرک در مخزن دستگاه HPLC قرار می‌گیرد. این مخزن باید کاملاً تمیز و عاری از هرگونه آلودگی باشد تا نتایج دقیق حاصل شود.
- تثبیت فاز متحرک در سیستم: قبل از شروع آنالیز، فاز متحرک باید از طریق پمپ دستگاه وارد سیستم شود تا ستون با آن پر شود و هیچ‌گونه هوای محبوس‌شده در سیستم باقی نماند. این کار باعث می‌شود ستون به خوبی شسته و آماده جداسازی ترکیبات شود.
- تنظیم جریان فاز متحرک: جریان فاز متحرک معمولاً در محدوده ۰.۵ تا ۱.۵ میلی‌لیتر بر دقیقه تنظیم می‌شود. جریان فاز متحرک باید با دقت تنظیم شود تا جداسازی بهینه و تکرارپذیر به دست آید.
- مدیریت فشار: در طول آزمایش، فشار سیستم HPLC باید به دقت کنترل شود. اگر فشار بیش از حد بالا رود، ممکن است به ستون یا سایر اجزای دستگاه آسیب برساند. معمولاً فشار به دلیل تغییرات در فاز متحرک، دما یا کیفیت ستون تغییر می‌کند.
نکات ایمنی و نگهداری فاز متحرک
- نگهداری حلال‌ها: حلال‌ها باید در ظروف بسته و در دمای مناسب نگهداری شوند تا از تبخیر و کاهش کیفیت آن‌ها جلوگیری شود.
- مدیریت ضایعات: پس از اتمام آزمایش، فاز متحرک نباید به صورت مستقیم به محیط زیست تخلیه شود. این مواد باید به شیوه‌ای ایمن جمع‌آوری و دفع شوند.
- تمیزکردن سیستم: پس از هر آنالیز، سیستم HPLC باید با حلال مناسب شسته شود تا از رسوب مواد در ستون یا لوله‌ها جلوگیری شود.
نتیجه‌گیری
انتخاب، آماده‌سازی و استفاده صحیح از فاز متحرک در HPLC از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است. با انتخاب فاز متحرک مناسب، آماده‌سازی دقیق و رعایت نکات ایمنی و بهداشتی، می‌توان به نتایج دقیق و قابل اطمینانی در جداسازی و آنالیز ترکیبات مختلف دست یافت.
بدون دیدگاه