کشت ارگانیسم ها به روش پورپلیت

مقدمه ای از پورپلیت :

روش پورپلیت که امروزه در آزمایشگاه‌های باکتریولوژی کاربرد گسترده‌ای دارد در ابتدا توسط فردی به نام رابرت کخ (Robert Koch) ابداع شد. در نمونه‌هایی که دارای جمعیت میکروبی و مخلوطی از انواع سلول‌ها هستند، می‌توان از روش پورپلیت برای تولید یک کشت خالص از میکروارگانیسم‌های موجود در این جمعیت میکروبی استفاده کرد. به طور کلی می‌توان گفت که هدف اصلی از انجام روش پورپلیت، جدا کردن یک کشت خالص از مخلوطی از جمعیت‌های میکروبیِ مختلف و نشان دادن مشخصات باکتری‌ها از جمله رنگ، بافت، اندازه، ارتفاع و غیره است. این روش همچنین برای شمارش تعداد موجودات زنده در مایعات مانند آب، شیر، ادرار یا کشت آبگوشت و همچنین تعیین فعالیت همولیتیک کلنی‌های عمیق برخی از باکتری‌ها مانند استرپتوکوک‌ها با استفاده از یک محیط آگار حاوی خون کاربرد دارد. شمارش باکتری‌ها به روش پور پلیت دقیق‌تر از روش کشت خطی است، اما به طور متوسط​، میزان شمارش کمتری را ارائه می‌کند زیرا میکروارگانیسم‌های حساس به گرما در صورت تماس با محیط گرم و آگار مذاب ممکن است از بین بروند.

تکنیک پور‌پلیت چیست ؟

روش پورپلیت (Pour Plate Method) یک تکنیک پرکاربرد در اغلب آزمایشگاه‌ها به ویژه آزمایشگاه‌های داروسازی، بالینی و صنایع غذایی است. این روش برای شمارش تعداد باکتری‌های خاص موجود در یک نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد.

برای انجام این آزمایش به ابزار زیر نیازمندیم:

پلیت ، لوله آزمایش ، پیپت 1 سی سی ، سرم فیزیولوژی ، محیط کشت PCA ، دستگاه کلونی کانتر ، انکوباتور ، نمونه ماده غذایی

روش کار پور‌پلیت :

در روش کشت به روش پورپلیت، به منظور تشخیص و شناسایی باکتری های اشرشیا کلی، یک میلی لیتر از نمونه آب را به لوله برلیانـت گـرین بـراث، حـاوی لولـه دورهـام اضـافه کـرده و همینطور 1 سی سی از نمونه آب را در یک پلیت خـالی ریختـه شود و بـامحیط کشت مک کانکی آگار بـه صـورت پورپلیـت دو لایـه کشت داده شود. پس از بـسته شـدن محـیط برای کشت به روش پورپلیت آن را بـه همـراه لولـه برلیانت گرین براث در دمای 37 درجه سانتیگراد به مـدت 24-48 سـاعت گرماگذاری گردید.

مراحل انجام کشت به روش پورپلیت:

۱. در اطراف پتری دیش استریل یا کف آن یک لیبل حاوی نام آزمونگر، تاریخ انجام آزمایش، نوع محیط کشت و نوع ارگانیسم‌هایی که باید به آگار ذوب شده اضافه کنید را بچسبانید. دقت داشته باشید که لیبل را نباید روی درب پتری دیش چسباند.

۲. برای کشت نمونه ممکن است نیاز به تهیه رقت‌های سریالی داشته باشید که منجر به کاهش سیستماتیک غلظت سلول‌ها در نمونه می‌شود. آماده سازی رقت‌های سریالی در صورتی ضروری است که تعداد سلول‌های نمونه بیش از ظرفیت پتری دیش حاوی آگار باشد. این ظرفیت معمولا با واحد CFU سنجیده شده و عددی بین ۳۰ تا ۳۰۰ CFU است. اگر تعداد سلول‌های نمونه بیش از  ۳۰۰ CFU  تخمین زده شود، کلنی‌ها با هم تداخل خواهند داشت.

۳. یک لوله حاوی ۱۸ میلی لیتر آگار ذوب شده تهیه کنید.

۴. آگار باید از قبل در اتوکلاو استریل شده باشد و سپس در لوله‌های آزمایشگاهی توزیع شود.

۵. دقت داشته باشید که آگار را در همان زمانی آماده کنید که قصد انجام آزمایش را دارید. آگار را باید به مدت ۳۰ دقیقه در اتوکلاو قرار دهید تا استریل شود و سپس آن‌ را به حمام آب ۵۵ درجه سانتی‌گراد منتقل کنید. آگار ذوب شده دیگر قابل استفاده نیست بنابراین آن‌را به مقداری که نیاز دارید تهیه کنید.

۶. ده دقیقه قبل از ریختن آگار در پتری دیش، آگار ذوب شده باید از حمام آب ۵۵ درجه سانتی‌گراد بیرون آورده شود تا به دمای ۴۸ درجه سانتی‌گراد قرار برسد. وقتی آگار به این دما رسید، آماده ریختن است. اگر آگار بیش از حد گرم باشد ممکن است باکتری‌های موجود در نمونه از بین بروند. از طرف دیگر اگر آگار بیش از حد خنک باشد، ممکن است حین جامد شدن گلوله گلوله شود.

۷. لوله حاوی نمونه مورد نظر خود را بردارید. نمونه باید به صورت یک کشت آبگوشت یا یک سوسپانسیون سلولی باشد که با مخلوط کردن سلول‌ها در بافر یا سالین تولید می‌شود. در صورت نیاز از رقت‌های سریالی استفاده کنید.

۸. درب پتری دیش را باز کنید و نمونه خود را به کمک پیپت سرولوژی یا سمپلر وسط ظرف پخش کنید. درب را ببندید. جریان نمونه را کنترل کنید تا از پتری دیش بیرون ریخته نشود.

۹. دقت داشته باشید که حین انجام آزمایش باید از تکنیک‌های آسپتیک استفاده کنید.

۱۰. درپوش لوله حاوی آگار ذوب شده را برداشته و لبه لوله را با استفاده از چراغ بونزن حرارت دهید.

۱۱. درب ظرف حاوی نمونه را باز کرده و آگار را با دقت در آن بریزید، درب ظرف را ببندید و با چرخاندن آرام پتری دیش، نمونه را با آگار مخلوط کنید.

۱۲. اجازه دهید آگار کاملا جامد شود.

۱۳. سپس پتری دیش را به صورت وارونه درون انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار دهید.

هدف از انجام پورپلیت :

هدف اصلی از انجام روش پورپلیت، جدا کردن یک کشت خالص از مخلوطی از جمعیت‌های میکروبیِ مختلف و نشان دادن مشخصات باکتری‌ها از جمله رنگ، بافت، اندازه، ارتفاع و غیره است.