روش کار با دستگاه HPLC

روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC):

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله تکنیک‌های جداسازی (Separation) محسوب می شود. در تمامی روش‌های کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام می‌شود. این تفاوت مقدار، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی می‌گردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان می‌کنند. در این رابطه  Cm و Cs به ترتیب نشان‌دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.

K=CS/CM

در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز متحرک مایع و فاز ساکن جامد می باشد. اساس کار دستگاه شامل برهم کنش نمونه و فاز ساکن مطابق قطبیت آنها است. در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌‌شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد.

روش کار با دستگاه HPLC (اجزاء و قسمت‌های مختلف دستگاه HPLC )

دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت‌های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود:

1-   مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌های شست و شو دهنده ستون ریخته شده است.

فاز متحرک متناسب با نوع نمونه شامل حلال های آلی مانند متانول و استونیتریل و یا حلال های آبی شامل آب، بافر، محلول های نمکی و یا سایر حلال های سازگار با دستگاه، قابل تغییر است.

2-   موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می‌گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیت‌ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیک‌ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال‌ها در ازای یک حلال خالص می‌تواند به‌کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می‌شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته می‌شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه‌ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می‌یابد.

3-   Degasser : قبل از ورود حلال به داخل پمپ دستگاه، باید هرگونه حباب هوا یا گاز زدوده شود. این کار توسط دستگاه هوا زدا صورت می گیرد که سیستم نیمه تراوای داخل آن گاز را تراوش نموده ولی اجازه خروج مایع را نمی دهد.

4-   تزریق‌کننده (Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ‌هایی با ظرفیت‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه‌بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس از آماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.

5-   ستون:  پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column) می‌شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی‌متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده‌ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمی‌کند. طول ستون‌های اصلی دستگاه معمولا حدود 30-10 سانتی‌متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته‌دار و یا متخلخل است، پر کرده‌اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد 3 تا 5 میکرومتر است.

ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم‌ترین ستون‌های غیرقطبی می‌توان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز (Detector) هدایت می‌شوند.

در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می‌کنیم. برای مثال در ستون‌های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شست و شو می‌دهند.

از انواع دیگر ستون می توان به ستون کربوهیدرات، آروماتک های حلقوی، ستون آمینی، کاتیونی، C8 و… اشاره کرد.
6-   آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود.

الف -از پرکاربردترین انواع آشکارساز، طیف‌سنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت نمونه اندازه‌‌گیری می‌شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می‌شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می‌بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم‌های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.

ب- آشکارساز ضریب شکست: اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می‌شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته است.

ج- آشکارساز فلورسانس، حساس‌تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند؛ درنتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.

از دیگر بخش های یک سیستم HPLC می توان به بخش کنترل کننده دمای ستون یا همان آون ستون اشاره نمود. یکی دیگر از بخش های این تجهیز،Mixer  است که حلال ها و نمونه را قبل از تزریق به ستون بصورت همگن مخلوط می نماید.

کلیه حلال ها قبل از قرار گیری به عنوان فاز متحرک توسط فیلتر های 2/0 میکرومتر فیلتر می شوند. هم چنین نمونه ها پس از فرایند آماده سازی و استخراج از فیلترهای سرسرنگی با منافذ 45/0 میکرومتر فیلتر می گردند. کلیه این امور به منظور محافظت از ستون و دتکتور جهت جلوگیری از ورود آلودگی و ذرات صورت می گیرد.